一、實驗目的

衰老是生物體在細胞、組織、器官結構與功能上表現出來的各種衰退過程的總稱，是一個自發而又與早期的程序化發育相對應的過程。其結果是導致個體存活力下降直至死亡。且該過程是不可逆的。人口老齡化是老年人口占總人口比例隨時間推移而不斷上升的一種動態過程，人口老齡化的總趨勢是老齡化的程度日趨加重。根據聯合國1982年的報告。在1950～2050年的100年間，全世界的老年人口將出現大幅度增長，而事實上，我國從20世紀70年代初生育率開始下降之時起，人口老齡化就已經開始了。至1982年。我國人口已經完成了從年輕型人口向成年型人口轉變，預計到2025年，15歲以下的兒童將占總人口的18.6％，65歲以上的老人將超過18.8％，即每5個人中就有1個老年人。到21世紀末。我國將成為老年型人口國家。腦老化是漸進的、不可逆的生理功能全面下降的過程。其結果直接與多種老年性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等密切相關，極大地影響了老年人的生活質量，給社會和家庭帶來巨大的負擔，對人類的發展將產生深刻影響。

腦衰老伴隨的認知功能損害是人類機體老化的突出表現之一，并可影響全身的衰老，成為影響人類生活質量的主要原因。但腦衰老的分子機制至今仍不十分明確。一直以來。很多學者都致力于衰老機制的研究，以期尋找出對抗衰老的有效途徑。衰老的機制是十分復雜的，但是，直到現在，還沒有一種學說體系可以全面解釋衰老的現象，人們對于延緩老化及衰老相關疾病的治療仍未找到有效線索。自從發現應用某些抗生素可抑制學習、記憶形成，長期記憶過程需要蛋白質參與后，從基因水平探索學習、記憶的分子機制已成為神經生物學家廣泛關注的焦點。而隨著各項研究的進展，有學者提出，只有在分子水平了解衰老的機制才能找到有效延緩衰老的方法，而快速老化小鼠的引入為這樣的研究提供了良好的平臺。    快速老化小鼠(senescence accelerate mouse, SAM)是日本京都大學Takeda教授經20多年精心培育而得到的一種近交系衰老模型鼠，包括SAMP(senescence accelerated-prone mouse)和SAMR(senescence accelerated resistant mouse)兩種品系。SAMP在渡過一段正常生長期(4～6月齡)后迅速出現行動反應遲緩、被毛光澤減退、脫毛、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜潰瘍、白內障、脊柱彎曲等老化特征。SAMR表現為正常衰老，一般作為SAMP的正常對照�？焖倮匣�癡呆模型小鼠SAMP8是SAMP系中的一個亞系，主要以學習、記憶能力障礙為老化特征，是目前公認的比較理想的自然衰老癡呆模型。迄今為止，SAM己被廣泛用于衰老相關性疾病及分子機制的研究。本節主要介紹該品系小鼠在筆者實驗室的建系及表型檢測，為進一步深入理解老化和癡呆的機制提供幫助。

二、實驗原理

神經行為學實驗是研究動物學習、記憶能力障礙的主要方法。其基本原理是利用動物覓食、求生、逃避傷害、喜暗惡明等本性設計實驗，觀察其近期和遠期學習記憶能力，評估其癡呆狀態。其方法主要有Morris水迷宮實驗、八臂迷宮實驗、明暗箱實驗、穿梭箱實驗、高架橋實驗、跳臺實驗等。

本研究運用Morris水迷宮檢測了不同月齡SAMP8學習、記憶功能的變化，結合老化度評價的結果，檢測筆者實驗室繁殖出的SAMP8是否建系成功，以及是否具有自然快速老化的特征，為今后的研究提供實驗動物模型。

三、實驗材料與方法

(一)實驗材料

1.所需實驗儀器  小鼠Morris水迷宮設備及軟件。

2.實驗動物  SAMP8及SAMR1研究隨機選取2月齡、6月齡、10月齡SAMP8各8只，同月齡SAMR1作為對照，經過老化度評分后進行Morris水迷宮檢測。

(二)實驗具體方法和操作步驟

1.老化度評分  參考文獻老化度評分標準，從反應性、被動性逃避反應、皮毛光澤、皮毛粗糙度、脫毛程度、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜渾濁、角膜潰瘍、白內障、脊柱后凸等11項指標對各組動物進行客觀評分。每項指標劃分為4～5級不等，標定分值。動物積分越高表明其老化度越高。

2.行為學評價  利用Morris水迷宮進行小鼠行為學分析。水迷宮實驗過程為第1天可視平臺訓練。連續5d的隱藏平臺獲得實驗和第6天的空間探索實驗3部分。每天訓練3次，每次使小鼠在不同區域下水，Morris水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區域，平臺即第5區域。位于第4區域內。每次游泳時間60s，每次訓練間隔1h左右。小鼠沒有找到平臺按60s計算逃避潛伏期。隱藏平臺獲得實驗檢測小鼠學習獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力。

MWM為一直徑160cm、高50cm的圓形水池，水池內壁被漆成黑色，池內水深23cm，水溫保持在(22±2)℃，房間內光照恒定，無光線直射在水池內。池壁上以4個等距離點將水池分為4個象限，在靶象限(設為第l象限)內距離池壁35.cm處放有一個直徑為12cm、高21cm的圓形白色站臺，站臺在實驗開始時位于水面上0.5cm。池壁內貼有不同形狀及顏色的標記物，每天實驗前將無毒可溶的白色染料加入水中混勻。迷宮上方安置連接顯示系統的攝像機。同步記錄小鼠運動軌跡。

3.可視平臺實驗  將平臺升至水面上0.5cm，實驗前將小鼠置于站臺上適應20s，隨后將小鼠隨機從不同象限(靶象限除外)面壁置入池內，小鼠登上站臺3s后終止記錄，最長記錄時間為60s，若小鼠在60s內不能上臺，引導其登上站臺適應30s，記錄為60s，最后將小鼠擦干放入鼠籠。

4.隱蔽平臺實驗  可視平臺實驗1d后將站臺降至水面下0.8～1cm，然后將小鼠隨機從不同象限(除靶象限外)面壁置入池內3次，每次記錄小鼠在60s內的游泳軌跡并進行分析，小鼠登上站臺3s后終止記錄，最長記錄時間為60s，若小鼠在60s內不能上臺，引導其登上站臺適應30s，記錄為60s，最后將小鼠擦干放入鼠籠。如此將小鼠置入游泳池，3個不同的象限入水點為一只小鼠一天訓練的數據。每天選擇的入水點應避免與前一天重復。測量平均上臺潛伏期，以評判小鼠的空間學習能力。該項訓練持續5d，在第6天開始進行空間探索實驗。

5.空間探索實驗  隱蔽平臺實驗結束后撤除水面下的站臺，然后將小鼠隨機從不同象限(除靶象限外)面壁置入池內3次，每次記錄小鼠在60s內的游泳軌跡并進行分析，最后將小鼠擦干放入鼠籠。測量小鼠在靶象限活動時間的比率和穿越站臺次數，以評判小鼠的空間記憶能力。

(三)實驗操作中的注意事項

SAMP8抵抗力較差，尤其是高齡組的小鼠，對外界環境的溫差變化較為敏感，護理不當容易死亡，因此，每次完成Morris水迷宮測試之后，要及時將小鼠的毛皮擦干，避免受涼導致死亡。

四、獲得的實驗結果

(一)老化度評分

SAMP8和SAMR1兩組小鼠老化度評分值均隨年齡增長而增高。但SAMR1組小鼠隨年齡增高老化度評分值增高不顯著(P>0.05)，而SAMP8組小鼠6月齡、10月齡的評分值較同組2月齡小鼠顯著增高(P<0.05)。與對照SAMR1組相比，SAMP8在6月齡、10月齡的評分值顯著高于同齡對照組(P<0.05)。表明兩組小鼠在1～12個月生存期間內，SAMR1組并未出現明顯的衰老表征，而SAMP8組從6月齡時即迅速出現明顯的衰老征象，比 SAMR1提前進入衰老期。

(二)Morris水迷宮檢測

經過檢驗，前6d學習有效，所有小鼠都能較快地找到平臺。隨后第7天撤出平臺，進行空間探索實驗。用Ethovision XT監測分析軟件記錄小鼠在目標區域的停留時間。

Morris水迷宮實驗發現，6月齡及10月齡高表達SAMP8隱蔽平臺實驗及空間探索實驗結果與同月齡SAMR1相比有顯著差異，與同月齡SAMP8相比，SAMR1均能在較短時間內找到平臺(P<0.05，圖15-6B和C)；同樣，在空間探索實驗中，與SAMP8相比，SAMR1在目標象限停留時間最長(P<0.05，圖15-6E和F)，與對照組相比有統計學差異P>0.05)，而2月齡SAMP8與SAMR1組相比無顯著性差異(P>0.05，圖15-6A和D)。

五、結果分析

(1)老化度評分是從外在形體及行為變化來評定機體的老化程度，反映了機體的衰老征象。從各組SAM的評定結果看，SAMP8組與SAMR1組在2月齡時評分差異無顯著性，而在6月齡、10月齡時SAMP8組得分均顯著高于SAMR1組。表明SAMP8組小鼠是經過一段成熟期后進入快速衰老期而出現明顯衰老征象的。

(2)Morris水迷宮實驗于20世紀80年代初由英國心理學家Morris設計。旨在用于檢測動物空間搜索和辨別的學習、記憶能力，以動物找到暗臺的逃避潛伏期作為評定學習、記憶能力的指標。本研究所得實驗結果顯示。第1天、第2天各組SAM找到暗臺的潛伏期均呈下降趨勢，說明均具有一定的學習能力，但從第2天開始到第6天，6月齡、10月齡 SAMP8小鼠的潛伏期顯著長于同齡SAMR1組。提示6月齡、10月齡SAMP8小鼠學習、記憶能力可能比同齡SAMR1組小鼠差，在空間記憶和辨別能力方面6月齡、10月齡SAMP8仍存在一定的障礙。說明筆者實驗室繁育的SAMP8穩定遺傳了自然快速老化的特征，可以作為研究老化相關疾病的動物模型。

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