分子生物醫學病理組織細胞免疫組化雙重免疫熒光染色掃描實驗外包委托技術服務操作流程
一.固定、脫水、包埋
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取組織放入4%多聚甲醛里面固定3-4小時,時間根據標本大小適當調整。
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取適當大小組織放入包埋盒中,進行脫水。每個染缸液體體積約200ml,每次脫水可以裝20個包埋盒。依次進入:
75%酒精1.5小時、95%酒精1.5小時、95%酒精1小時、無水乙醇1.5小時、無水乙醇1小時、二甲苯一號0.5小時、二甲苯二號0.5小時。
打開包埋機,分別開啟冷臺,冷點,石蠟槽,組織槽進行工作。然后用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機組織槽中加熱溶解。將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中,然后再放入石蠟飯盒一號進行第二遍浸蠟,然后石蠟飯盒二號,進行三次浸蠟。
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選大小符合的模具,先調整機器滴蠟的速度,不宜過快防止有氣泡。然后在模具中滴入液體石蠟,然后從飯盒二號中拿出浸后的包埋盒,打開用鑷子取出組織放入模具中。然后用包埋盒的另一半蓋住模具,再滴入少許石蠟后放到冷臺上冷卻。按上述步驟繼續包埋下一個蠟塊。
二.切片、制片
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打開切片機,固定蠟塊(可提前4度冰箱預冷一下),調整刀片和蠟塊的距離。然后調整切片厚度,先粗切,看到完整的蠟片并且有組織后切換厚度,調整到自己想要切的厚度。用力均勻,右手搖動切片,左手用毛筆接片。如片子打卷,可以用毛筆按著蠟片的邊緣再緩慢切,這樣可以得到相對平整的片子。
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用毛筆和鑷子將片子或者帶狀片子托起,放入水槽中展片,水溫在40度左右。然后用防脫片載玻片輕輕撈起,載玻片的邊緣盡量不要觸碰水槽底部,防止底部氣泡上浮殘留在片子上。然后標注切片編號放到烤片機上烤片30分鐘。
三.組織化學染色
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室溫脫蠟、水化:二甲苯一號10分鐘、二甲苯二號8分鐘、二甲苯三號8分鐘、無水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。
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熱抗原修復,換新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修復液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘,最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。
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免疫組化筆畫圈:取出組織,甩干水分,可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫圈圍住組織,圓圈完整。
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滅活內源酶活性:將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見二抗說明書),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。
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封閉非特異性位點:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒內,室溫10分鐘。
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甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然后放入濕盒內4攝氏度過夜。(一抗濃度見抗體說明書,提前稀釋后分裝,并在負二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。
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第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。
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甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
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每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
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每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色,自來水沖洗。
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蘇木素復染,1-2分鐘,細胞核變藍色即可終止,自來水或者PBS沖洗反藍(可用0.5%氨水反藍)。
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1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗三分鐘。
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脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無水乙醇4分鐘、二甲苯一號3分鐘、二甲苯二號3分鐘。
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涼干片子后滴加適量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾干半天即可。
顯微鏡下拍照。
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聯系我時請說明是在分子生物醫學微生物基因肌酐血常規檢測肝功能腎功能檢測分析診斷篩查臨床醫學實驗動物模型實驗外包委托大小鼠腦室海馬腦立體定位注射慢病毒藥物細胞實驗創新藥物臨床前研究試驗毒理代謝藥理藥代動力學藥效實驗安全性評價,雙轉基因app/ps1小鼠價格優惠腫瘤疾病原位異位荷瘤小鼠動物模型建立代養小鼠代養大鼠實驗動物寄養服務看到的，謝謝！
