蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務簡介:
蛋白質印跡的發明者一般認為是美國斯坦福大學的喬治·斯塔克(George Stark)。在尼爾·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化學》(Analytical Biochemistry)中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡( Western Blot) 是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術,現己廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。
原理:
與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種:
i. 放射自顯影
ii. 底物化學發光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用第一種方法,發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行,操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，用于檢測經電泳或斑點雜交后固定于膜上的蛋白質的檢測。特異、穩定的液態酶標抗體和相應的底物，保證了快速、準確的檢測；而避免了放射性物質的使用，現已成為蛋白分析的一種常規技術，對蛋白進行定性和半定量分析。
北京生物公司 有豐富的蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務經驗，成功完成了各種蛋白的檢測，除了傳統的流程外，公司也掌握了快速轉膜法（一天完成WB），紅外二抗檢測（Oddssey）等技術。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務操作流程：
1.蛋白質抽提
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務實驗對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白質定量：按BCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。
3. 變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE):將準備好的樣品液和預染蛋白marker分別上樣，標準加進第一個孔中，電泳分離蛋白。
4. 蛋白質轉移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，300mA恒流條件下，4°C轉移90分鐘左右。
5. western blot膜的封閉和抗體孵育。
膜在5％脫脂奶粉(磷酸化蛋白用BSA)溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。
封閉過的膜加入一抗4°C孵育過夜，抗原抗體結合。
加入HRP標記的二抗體以結合一抗，室溫孵育膜1小時。
6. western blot結果檢測：化學發光法檢測，膜與化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯影。
當加入的二抗選擇外紅熒光二抗時，用Oddssey曝光條帶。
7. western blot數據分析，可定性、半定量分析。
8. 提供實驗報告，包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結果的相關數據。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務樣品要求:
客戶需新鮮或正確保存的蛋白樣品，目的蛋白陽性表達樣品（如果有陽性表達的細胞或組織）， 檢測目的蛋白的一抗（建議由科佰生物代購）。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務樣品要求為:
·裂解樣品總蛋白量＞500ug/樣品；
·細胞樣品總蛋白濃度＞1mg/ml；
·組織樣品總蛋白濃度10-15mg/ml。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務說明:
1. 建議提供目的蛋白陽性表達樣品（純蛋白或有陽性表達的細胞或組織）作為陽性對照 ；
2. 每張膜（小號）可檢測1-8個樣品，大號膜可檢測1-24個樣品；
3. 一抗需在正確條件下保存，避免污染及反復凍融；
4. 如需進行數據分析，請另詢價。
蛋白印跡WB（Western Blot）實驗外包服務提交的產品和資料:
1.曝光結果（膠片和掃描圖）；
2.實驗報告。
| 蛋白抽提 | 總蛋白 |
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2-3周 |
| 蛋白抽提 | 核漿蛋白分開 |
|
2-3周 |
| 蛋白定量 | 提供蛋白測定總蛋白濃度 |
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2-3周 |
| Western Blot預實驗 | Western Blot 檢測一抗體特異性 |
|
2-3周 |
| Western Blot | Western Blot 標準服務(包括蛋白質提取和定量，Tubulin標定，不含一抗） |
|
2-3周 |
| SDS-PAGE | 客戶提供蛋白樣品 |
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